• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1989001971A1
    申请号:PCT/JP1988/000246
    申请日:1988-03-09
    公开日:1989-03-09
    发明作者:Masamichi Takagi；Keiji Yano；Hiroyuki Horiuchi；Toshihiko Ashikari
    申请人:Suntory Limited；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明細書
    [0002] 発明の名称
    [0003] 酸性プロ テ ア一ゼ、 酸性プロ テア ーゼ遺伝子およ び酸 性プ ロ テアー ゼ の製造
    [0004] 技術分野
    [0005] 本発明 は、 糸状菌 リ ゾブス · 二 べ ウ ス ( R h i z o p u s n i v e u s ) 由来の酸性プ ロ テアーゼ、 その遺伝子及びそ の遺伝 子を含有する 組換えベ ク タ ーな らびにそ のべ ク タ 一を用 いた酸性プロ テア ーゼ の製造に関する。
    [0006] 従来の技術
    [0007] プ ロ テアーゼは蛋白質を分解する 酵素で、 食品加工ェ 業において、 大豆蛋白や魚肉の加水分解な どに用い ら れ てお り 、 ま 、 皮革工業、 醸造工業あ る い は洗剤工業な どの分野において も広 く 用 い ら れて い る 。 なかで も広 く 用い ら れてい る酸性プ ロ テア一ゼは、 酸性域に至適 pHを もつ一群のプ ロ テ ア一ゼで、 そ の活性中心に ァ ス ノ、 ' ラ ギ ン酸を も つ こ とか ら、 ァ ス ノ ルテ ッ ク · プロ テ ア一ゼと も呼ばれる。
    [0008] こ のよ う な工業用の プ口 テア ーゼを ¾済的に生産する う えで微生物の利用が有望であ る。 例え ば、 リ ゾプス属 糸状菌は数種の酵素を菌体外に分秘する こ と が知 ら れて いる が、 酸性プロ テア ーゼは、 その中で も最も 大量に リ ゾプス属糸扰菌か ら分泌さ れる酵素群の一つで あ る 。 こ れま でい く つかの酸性プロ テア 一ゼ.について そ の性質が 調べ ら れて い る 。 例え ば、 リ ゾブス - チ ネ ン シ ス （ R h i ζ 0 pus cbinensis) Φ生産する酸性ブロ テア 一ゼは、 その性 質がよ く 調べられてお り （Fukumoto, J. e t aし， Sgric.
    [0009] Biol. Chern. 31, 710 ― 717 (1967))、 その全ア ミ ノ 酸 配歹 ίが' 定され（Delaney, B. et al. , J. Biol . C em. 262, 1461 - 1467 (1987))、 ま た三次構造について も研 究されている （Subrataanian, E . et aし， Proc. N a t 1. Α cad. Sci . USA. } 74. 556 ― 559 (1977)) 。 しカヽし、 そ のア ミ ノ 酸配列 （第 2 図参照） は、 本発明の も の （第 1 図参照》 と はその配列において約 7 0 %のホ モ ロ ジ一が 見ら れる も の.の、 明 らかに異な って い る 。
    [0010] ま た、 こ の遺伝子を舍むべク タ一を利用 したプロ テ ァーゼ生産例も知 られていない。 一方、 リ ゾブ ス · 二べ ウ ス の酸性プロ テア一ゼについては、 ク ロ ノ ら によ って その性質が調べ られ、 ま たその ア ミ ノ 酸組成の解圻もな さ ήてい る が （Karono e t a 1. , Agr i c. Biol . Chem. , 35,
    [0011] 1668 - 1575 (1971) ) 、 そ のア ミ ノ 酸配列や遺伝子の塩 基配列について明 らかに される には至っ ていない。 また、 ァ ミ ノ 酸組戒 も本発明のも の と ば明 らかに異な っている。
    [0012] リ ゾプス属を舍む糸 ^菌における 分子生物学的研究ば、 それまでの遺伝学的知見が豊富であ る ノ ィ ロ ス ボラ ' ク フ ッ サ 1, _euro_s ora era _s aノ.ゃ ァ ス ぺノレキ ラ ス · 二 ド ラ ン ス (Aspersi 1 lus ni durans)において、 1981年頃力、 ら開 始さ れた。 こ れば、 それまで古典遺伝学 レ ベルで ^究さ れて いた物質の代謝、 合成経路に関与する酵素の制御機 構を、 近年急激な発展を遂げて き た遺伝子組換え技衙を 利用 して解明 しょ う と した も のであ る。 ！ !L crassa の qa gene cluster ( シ ュ ノヾイ ツ ァ 一 (Schweizer, ίΐ . e t a 1. , Proc. Natl . Acad. Sci . , 795 1955, 1982) や ni_d uran s の Sporulation specif ic gene ( チ ン ノ、 '一レ ィ ク (Timberl ake) , W. E. et al . , Cel 1 , 26 , 29, 1981 ;
    [0013] ォ一ァ (Orr) , W. e t al . , Proc. Natl . Acad . Sci . , 79, 5976, 1982) などばその最初の例で あ る 。 その後も 多 く の遺伝子が単離、 研究され、 学問的な知見を蓄積 し つつあ る 。
    [0014] こ れに対 して、 産業上有用な糸扰菌において は、 分子 生物学的ア プ ロ ーチは極 く 最近にな っ てよ う や く 開始さ れた。 こ の分野の成果と しては、 ト リ コ デラ ム ' リ ーサ ィ (Trichoderm reese i) の ェ キ ソ セ ロ ビ オ ノヽ ィ ド ロ ラ 一 ゼ I 遺伝子 （ シ エ ー メ イ カ 一 （Shaemaker) , S. e t a 1. , B iotechnol. , U 691, 1983； テ リ 一 （Terri) , T. et al： Biotechnol . , LL 696, 1983) やァ ス. ぺ ゾレギ レ ス - 二 ガ一 (Aspergi 1 lus n i gar ) のグゾレ コ ア ミ ラ ー ゼ遺伝子の 単離 （ ' — エ フレ （ B o e 1 ) , E . et al . , E»B0 J .5 _3 , 1097, 1984 ; ,1 —ェ ゾレ （Boel ) , Ε . e t al . , EMBO J . , _3., 1581', 1984) をあ げる こ とがで き る。 リ ゾプス属で は、 前に示 し た リ ゾ プ ス - チ ネ ン シ ス の酸性プ ロ テ ア ー ゼ以外に は、 リ ゾ プス · オ リ ザ ェ （ Rizopus Ory zae) の グ ル コ ア ミ ラ ーゼ遺伝子の単離 （ ァ シ カ リ （Ashikari) , T . et al . , Agric. Biol. Chem. , 50, 957 , 1986)力 知 られてい る の みであ る 。 発明の開示
    [0015] こ のよ う に、 リ ゾプス属の遺伝子はほ とん ど単離され ていない。 特に、 リ ゾブス ' 二べウ スでは、 その産業上 の利用性が高いに もかかわ らず、 遺伝子を単離 し、 それ . を産業に利用する 試みに閿する 報告ば知 られていない。
    [0016] ま た、 ひ ゾブス属で ば、 鐘式培養 （ いわゆる 「ふす . ま 」 培養） によ ら ない と高活性の酵素を得る こ とができ ない こ とが知 られてい る。 しかるに、 こ のよ う な建式培 養即ち固体培養は、 液体培養によ る 生産に比べて大量培 養が困難であ り 、 酵素の生産コ ス ト が上昇する とい う 問 題がある。
    [0017] 本発明は、 上記の問題を解決 し、 遺伝子工学の手法を 用 して、 液体培養によ り 経済的に リ ゾプス属の酸性プ 口 テア一ゼを生産する ために、 リ ゾブス - 二べウ ス の酸 性プロ テア一ゼをコ ー ドする新規な遺伝子を取得し、 そ の塩基配列を解明する と と も に その遺伝子を組み込んだ べク タ一並びに形質転換体を用 いて当該酵素を生産する 方法を提供する こ とを 百的とする。
    [0018] 本発明者ら は、 リ ゾブス · 二べウ スの培養物中の酸性 プ テアーゼの遺伝子を単難し、 そ の全塩基配列を '决定 する こ と によ り 、 本発明を完琅 し、 局時にこ のプロ テ ァ一ゼの構造 （ア ミ ノ 酸配列） も明 らかに した。
    [0019] 徒って、 本発明 は酸性プ ロ テアーゼを、 例えば遺伝子 工学的手法によ り 改良する こ とや、 適当 な宿主で当該酵 素を大量に生産（ 例え ば液体培養によ り 生産） する こ と な どの手段を可能に した も のであ る 。 さ ら に本発明は、 当該新規な酸性プロ テ アーゼを種 々 の宿主細胞内で生産 する ため の組換え べク タ 一の製造を可能な ら し め る も の であ る。
    [0020] 図面の簡萆な説明
    [0021] 第 1 図 （ a ) ない し第 1 図 （ d ) は酸性プロ テア 一ゼ 遺伝子を舍む D N A断片の塩基配列 と こ の塩基配列か ら 導かれる ァ ミ ノ 酸配列を示す一連の図である 。
    [0022] 第 2 図 （ a ) および第 2 図 （ b ) は、 リ ゾプス · チネ ン シ 久酸性プロ テア一ゼ のア ミ ノ 酸配列を示す一連の参 考図であ る。
    [0023] 第 3 図はィ ン ト ロ ン のない酸性プロ テ アーゼ遺伝子を 酵母由来 G A P プ ロ モ ー タ ーに結合 した遺伝子を舍むべ ク タ 一 P Y P R 2 7 3 1 の製造過程図で あ る 。
    [0024] 第 4 図はイ ン ト ロ ン のない酸性プ ロ テア一ゼ遺伝子及 び当該遺伝子由来のプ ロ モ ータ ーを舍むベク タ ー P Y P R 7 3 1 およびプロ モ ータ ーを舍ま ない コ ン ト ロ ー ル の ベク タ一 P Y P R 2 0 9 の製造過程図であ る 。
    [0025] 尚、 第 3 図および第 4 図中、 H , E , P , S およ S P はそれぞれ、 H i n d BI 、 E c o R I 、 P s t I 、 S a 1 I および S p li I の切断認識部位を示し、 P R 0 は、 リ ゾプス 由来酸性プロ テア ーゼの—搆造遺伝子を示す。 .ま た、 多数の点を付 した ブロ ッ ク は、 リ ゾブス由来酸性プ 口 テア一ゼ遺伝子を舍む リ ゾブ ス由来の D N Aを示 し、 黒で塗り 潰 したブ ロ ッ ク は イ ン. ト ロ ンを示し、 白い空白 のブ ロ ッ ク ば酵母 T R P I の遺伝子を示す。 さ らに、 I R ！ ば酵母 2 ii m Ό N A中 の ィ ン ノ、'一テ ィ ッ ト ♦ リ ビ一 ト領域を示す。
    [0026] 第 5 図ば本発明酵素の活性の pHによる影響を示すダラ フであ る 。
    [0027] 祭明を害施する ための ま しい形態
    [0028] 本発明の酸牲プロ テァ ーゼは、 リ ゾブス · 二 べウ スに 属する糸扰菌由来の も ので あ る 。
    [0029] 本発明の酸性プ π テァーゼは次式 I のァ ミ ノ 酸配列を 有す る ：
    [0030] X- A La Ser G 1 Ser Val Pro Met Val ftsp Ty r
    [0031] , . G 1 u As n As V a 1 Glu Tyr Tyr Gly Glu Val 20 T r Val Gly Thr Pro &ly lie Ly s Leu Ly s 30 Leu As Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Met
    [0032] Tr p Phe Ala Ser Thr Leu C s Ser Ser Cys 50 Ser ksn Ser His Thr Lys T r Asp Pro L s
    [0033] L s Ser Ser Thr Tyr 41a Ala Asp Gly Arg 7 Thr Trp Ser lie Ser Tyr Gly As Gly Ser 80 Ser Ala Ser Gly lie Leu Ala Thr As A s n
    [0034] Val As n Leu Gly Gl Leu Leu lie L s Lys 00 Gin Thr lie Glu Leu Ala Lys Arg Glu Ser
    [0035] Ser Ala Phe Ala Thr Asp Val lie Asp Gly 20 Leu Leu Gl Leu Gly Phe ksn Thr lie Thr 30 Thr Val Arg Gly Val Lys Thr Pro Val Asp
    [0036] A s n Leu lie Ser Gin Gly Leu lie Ser Arg 50 Pro lie Phe Gly Val Tyr Leu Gly lys Gin 1 60 Ser Asn G 1 y Gly Gly Gly GIu Tyr lie Phe 1 70 Gly Gly T r Asp Ser Ser Lys Phe L s Gl 80 Ser Leu Thr Thr Val Pro lie Asp Asn Ser 1 90 GIu Gly Phe Trp Gly Val Thr Val Lys Ser Thr Lys lie Gly Gly Thr Thr Val Ser Ala Z 1 I Ser Phe Asp A 1 a lie Leu sp Thr Gly Thr Z 20 Thr Leu Leu Leu Leu Pro sp As Val A 1 a Ala Lys V a 1 A 1 a Arg Ser T r Gly Ala Ser Z 40 Asp Asn Gly As Gly Thr Tyr Ser lie Thr 2 50 C y s As Thr Ser Lys Leu Gin Pro Leu Val Z 60 Phe Thr Leu Gly Ser Ser Thr Phe GIu Val 2 70 Pro Ser Asp Ser Leu lie Phe GIu Lys As
    [0037] Gl Asn Lys C y s lie Ala Gly Phe A 1 a A 1 a Z 90 Gl Gly Asp Leu A 1 a l ie Leu Gly s Val Phe Leu Lys Asn Asn Tyr Val Val Phe Asn 3 10 Gin GIu Va 1 Pro GIu Val Gin lie Ala Pro 3 20 Val Ala Asn COOH
    [0038] ( I ) 中、 X は水素原子ま た ば次式 m ：
    [0039] Met Lys Phe Thr Leu lie Ser Ser C s Va 1
    [0040] 1 a Leu Ala A 1 a Met Thr Leu A 1 a Val GIu
    [0041] Ala A 1 a Pro Asn Gly Lys Lys l ie Asn lie
    [0042] Pro Lea Ala Lys Asn Asn Ser T r L s Pro Se r Ala L y s As n Ala Leu A s n Lys la Leu
    [0043] Ala Lys Tyr As n rg Ar g Lys V a 1 G 1 y Ser
    [0044] Gly Gly lie Tlir Thr G lu
    [0045] C M )
    [0046] のア ミ ノ 酸配列で表さ れる ペプチ ドを示す） 。
    [0047] 従来のプ テア一ゼ と ば異な る新規な酸性プロ テア一 ゼであ る本発明の酸性プ π テア ーゼは、 糸找菌 リ ゾプス • 二べウ スを通常の方法で培養 して得 られる培養液また は培養培地か ら抽岀、 精製して得ら れる が、 市販さ れて いる リ ゾブス · 二べウ ス の培養液の濃縮物であ る酵素剤 ダルクザィ ム （天野製薬社製） か ら精製して得る こ と も でき る。
    [0048] 本発明の酵素は、 上記の培養液 （ ある いは培養培地） また はダル ク ザィ ム溶液か ら水に不溶の物質を除いた後、 ア セ ト ン沈緵物を水に溶解せ しめ、 イ オ ン交換ク ロ マ ト グラ フ ィ ーゃ分子ふる いク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一によ っ て精 製さ れる 。
    [0049] 上記の如 く して精製された酵素は、 S D S ボ リ ァ ク ルア ミ ドゲル電気 m動 （ S D S — P A G E ) で そ の純度 を確認後、 常法に従いア ミ ノ 酸分折及び N末端ア ミ ノ 酸 配列の分折を行う こ とができ る。 ま た、 本酵素蛋白質の ペプチ ド断片のア ミ ノ 酸配列を知る にば、 上記精製酵素 を、 適当なプ ロ テアーゼで分解 して得ら れる ぺプチ ド断 片を、 高速液体ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一で精製後、 ア ミ ノ 酸 配列自動分折機を用いて調べればよ い。 こ のよ う に して得 ら れた本発明の酸性プロ テアーゼは、 ク ロ ノ ら に よ っ て報告さ れてい る リ ゾプス · 二 べ ウ ス由 来の酸性プロ テア ーゼ と は、 ア ミ ノ 酸組成、 反応至適 pH 等において異なる も のであ り 、 さ ら に、 本酵素のァ ミ ノ 末端側のア ミ ノ 酸配列、 およびその構造中に あ る べプチ ド断片の ァ ミ ノ 酸配列は全 く 新規な も のであ る 。
    [0050] 本発明の酸性プロ テアーゼ遺伝子は、 リ ゾプス · 二べ ウ ス に属する糸状菌由来の も のであ る 。
    [0051] よ り 詳 し く は、 本発明の酸性プロ テア ーゼ遺伝子は、 次式 Π ：
    [0052] Y- GCC AGT GGC TCT GTT CCT ATG GTT GAT TAT 30
    [0053] GAA A AC GAT GTT GAA T G TAC GGT GAA GTC 60
    [0054] ACT GTT GGT ACT CCT GGT ATT AAG CTC AAA
    [0055] CTT G T TTT G T ACT GGT TCT TCT GAT ATG 1 20
    [0056] TGG TTT GCA TCC ACT TTA TGC TCT TCT TGC 50
    [0057] AGC AT TCT CAT ACT A AG TAT GAT CCT AAA 80
    [0058] AAA TCA AGC ACT TAC GCT GCC GAC GGT CGC 2 I 0
    [0059] ACT TGG TCC ATC TCT TAC GGT G T GGC TCT 2 0
    [0060] AGC GCA AGC GGT ATC TTA GCT ACA GAG AAT 2 70
    [0061] GTC A AC CTT GGA GGT CTC TTG ATT AAA A A G 3 00
    [0062] CAA ACT ATT GAA TTA GCC AAG CGT GAA TCT 3 30
    [0063] AGT GCA TTC GCT ACA G T GTG ATT GAT GGT 3 60
    [0064] CTC TTG GGT CTT GGT TTC AAC ACG ATT ACA 3 90
    [0065] ACC GTT CGT GGC GTC AAG ACT CCA GTC GAC 4 20
    [0066] Ai T TTG ATC AGT CA A GGT TTG ATC AGC AGS 4 50 CCC ATC TTC GGT GTT TAT CTC GGT AAG CAA 80
    [0067] AGC AAC GGA GGT GGA GGT GAA TAT ATC TTT
    [0068] GGT GGC TAT GAC TCC TCC AAG TTC AAG GGT
    [0069] TCC TTA ACT ACT GTC CCT ATC GST AAC TCA 70
    [0070] CAA GGC TTC TGG GET" GTT ACT GTC AAG AGC 6 00
    [0071] SCC AAG ATA GGT GGC ACA ACA GTT TCT GCT 6 30
    [0072] TCC TTT GAT GCT ATC CTC GAC ACT GGT ACC 6 60
    [0073] ACT CTT ΤΤδ CTT CTT CCT GAT GAC GTT GCT 6 90
    [0074] GCA. 4 AG GTG GCT AGA TCT TAT GGT GCT TCC 20
    [0075] GAC AAC GGC GAT GGT ACT TftC AGT ATC ACC 50
    [0076] TGT GAT ACT TCC AAG CTT C A CCT CTT GTC 7 80
    [0077] TTC ACC CTT GGT TCT TCC ftCC TTC GAft GTT 8 10
    [0078] CCC TCT &AC TCC CTC ATC TTT GAA AAG GAT B 40
    [0079] GGT AAC ΑΑδ TGT ATT GCT GGT TTT GCT GCT 3 70
    [0080] GGT GGT SAT CTT GCC .41 C TTG GGT GAT GTC 9 00
    [0081] TTT TTG AAG AAC AfiC TAT GTT GTC TTT AAC 7 30
    [0082] Ci G.4A GTC CCT Q GTT CAA. ATT GCA. CCT 9 60 GTT GCC AAT TAA 9 72
    [0083] ( 2 )
    [0084] (式中、 Yは存在しないか或い は次式 IV ：
    [0085] AAG TTC ACT TTA ATC TCC TCC TGT GT A
    [0086] GCA CTT GCT GCC ATG ACA CTT GCT GTC GA
    [0087] GCT GCA CCC AAC GGC &AG AAft ATT AAC ATT
    [0088] CCT TTG GCC AAG AAC AAC AGC TAC AAA CCT
    [0089] AGC GCC AAA A T GCA CTT AAT AAG GCT CTC GCC A A G TAC A T AGA AG A A AG GTT GGA AGC
    [0090] GGA GGA ATT ACA ACC GAG
    [0091] ( IV )
    [0092] で表さ れる D N A塩基配列を示す）
    [0093] で表さ れる D N A塩基配列あ る い は実質的に こ れと 同等 な生物学的活性を有する ¾基配列か らな る。 こ こで、 式 IVの塩基配列は酸性プロ テア一ゼ の プ レ ブ口 領域を コ 一 ドする配列である。 こ のプ レプロ領域の コ ー ド配列の直 前に は翻訳開始コ ド ン であ る A T Gが結合 している 事が 好ま しい。
    [0094] 本発明の酸性プ π テア一ゼ遺伝子を単離.す る に は、 例 えば上記の よ う に して決定された リ ゾプス · 二べウ ス の 酸性プロ テア一ゼ蛋白質のぺプチ ド断片のァ ミ ノ 酸配列 ' (後記実施例 1 に示す） を利用する こ と がで き る 。
    [0095] こ のペプチ ド断片の ア ミ ノ 酸配列の中から、 適当な大 き さ のァ ミ ノ 酸配列 （でき る だ けコ ド ン数の少ないア ミ ノ 酸を舍むよ う な配列を も つぺプチ ド断片が好ま し い ） をコ ー ドする D N A断片を化学的に合成 し、 こ れを プ 口 一ブと して、 リ ゾプス · 二べウ ス の全 D N A の断片が ク ロ 一 ン さ れた遺伝子ラ イ ブ ラ リ 一力、 ら、 目的 とす る ク ロ ー ンを選択する。 遺伝子の ラ イ ブ ラ り 一は、 常法に 従っ て得る こ とができ る。 即ち、 酸性プロ テ ア 一ゼ産生 能を有す る リ ゾプス ' 二べウ ス （例えば I F 0 4 8 1
    [0096] 0 ) の培養菌体か ら全 D N Aを抽出 し、 こ れを適当 な制 限酵素で切断 して、 得 られる D N A断片を適当 なべク ター （好ま しい も の と して、 例えば P B R 3 2 2 があ げ られる） に揷入後、 適当な宿主細胞、 例えば大腸菌を形 質転換する こ とによ っ て目的の遺伝子ラ イ ブラ リ ーが得 ら れる 。
    [0097] 上記の化学合成 D N A靳片をプ —ブ と して当該遺伝 子ラ イ ブラ リ ーか ら ス ク リ ーニ ングされたク ロ ー ン のブ ラ ス ミ ド D N Aは、 制限酵素解 などによ り 、 目的の遺 伝子が挿入さ れてい る かを確認後、 揷入遺伝子領壊の D N A配列を常法 （例えばサ ンガー ら の方法） に従い決定 する。
    [0098] 上記方法に よ り 、 本発明によ って新規な酸性プ口 テ ァーゼ遺伝子の 5 3 と 3 ' の非翻訳領域および構造遺伝 子の塩基配列が決定さ れた。 ま た、 当該酸性プロ テア一 ゼ遺伝子は、 後記実施例に詳逑する とお り 、 イ ン ト ロ ン を含んでい る こ とが明 らかにな っ た （第 1 図 （ a ) 〜 ( d ) 参照） 。 .
    [0099] こ の結果、 本発明を用いれば徒来その遺伝子配列が不 明であ っ たため不可能であ った、 遺伝子工学的手法を用 いた、 リ ゾプス * 二べウ ス の酸性プロ テアーゼ生産菌の 育種や他の ^質転換株によ る 当該酵素の生産が可能とな る。 即ち、 本発明によ り 明 らかにな っ た遺伝子 （好ま し ' く は ィ ン ト α ンを舍ま ない遺伝子） 又は、 そ の翹訳開始 コ ド ン A T G の 5 ' 傷上流に適当な発現調節領域 （ プロ モ一タ ー領域） を連結した D N A断片を舍むベク タ ーに よ っ て形質転換された細 （好ま し く は微生物細胞、 例 えば酵母ま た は大腸菌） を用いて、 当該酸性プ ロ テ ア一 ゼを効率よ く 生産する こ とが可能と なる 。 尚、 当該酸性 プロ テア一ゼ遺伝子は、 例えば部位特異的変異 （ si te d irected mutagenesis)法、 つ フ一 (Zo丄 ier) , Μ- J·および ス ミ ス （Smith) , M .： Nucl . Acid. Res . > 10 , 6487 , 138
    [0100] 2; モ リ ナガ （Morinaga) et a 1. , Bio/TECHNOLOGY, vol.
    [0101] 2， 636, 1984)な どを用い る こ とによ り 、 そ の遺伝子か ら イ ン ト ロ ンを除いて、 後記実施例に示すよ う に 当該酵 素蛋白質領域のみをコ ー ド して い る 式 Π の塩基配列に変 換する こ とができ る。
    [0102] 目的の遺伝子を形質転換箱胞中で効率良 く 発現させる にあた っ ては、 そ の遺伝子を種々 の ブロ モ一タ ー と連結 し、 その発現量を比較 - 検討で き る こ とが好ま しい。 こ の と き 、 目的遺伝子の翻訳開始コ ド ン A T G の 5 ' 倒上 流に、 後述する E c 0 R I のよ う な適当 な制限酵素の切 断認識部位を挿入 してお く こ と は、 一連の操作を簡便に する う えで有用であ る 。
    [0103] 当該遺伝子の発現にあた り 、 プロ モータ ー領域の挿入 位置によ り 、 当該酸性プロ テアーゼの プ レプロ 領域を舍 む前駆体蛋白質と して、 あ る い は成熟蛋白質 と して も、 目的酵素を生産 ' 取得する こ と がで き る 。 さ ら に は、 後 記実施例で詳述する よ う に、 適当な発現系を選べば、 プ レプ ロ領域を舍む前駆体蛋白質および成熟蛋白質の両者 を同時に培地中に分铋させて、 目的 とす る蛋白質を得る こ と も可能となる 。 菌体^に当該蛋白質を分秘 · 生産さ せる こ と は、 目的酵素の精製を行う う えで、 あ る い は、 当該酵素の産業上の利用面か ら見ても極めて有用な こ と であ る。
    [0104] 尚、 本発明の遺伝子の製造にあた り 、 リ ゾブス - 二べ ウ ス の染色体 D N Aの遺伝子ラ イ ブ ラ リ 一か ら製造する 例で説明 したが、 別法と して、 前記プ 一ブを使用すれ ば当該菌の m R N Aか ら調製した c D N Aの中から こ の D N Aプロ ーブとハイ ブ リ ダィ ズする c D N A と して本 発明の遺伝子を製造する こ と も可能であ る。
    [0105] ま 'た、 当該酸性プロ テア ーゼを生産する ため の形質転 換体の製造にあた っては、 宿主が彤質転換された酵母で あ る 例を後記実施例 .に示したが、 宿主は,、 他の組換え体 細胞 （好ま し く は微生物細胞） で も良い。 更に、 実施例 で示した リ ソ 'ブス の酸性プロ テアーゼ遺伝子由来のブロ モータ一や酵母由来のグ リ セ ルアルデヒ ド 3 -リ ン酸脱水 素酵素遺伝子 （ G A P ) の プ ロ モー タ ーを持つ発現べク ターに限 らず、 その ¾種々 の凳現べク タ 一を利用する こ とによ り 、 本発明の酸性プロテアーゼの生産を行う こ と も可能であ る 。
    [0106] 以下、 実施例にて本発明をさ らに詳細に説明する。 実旌例 1
    [0107] (1) 酵素の锖製
    [0108] 本発明の酵素の精製は以下の如 く 行っ た。 なお、 特に 記載しない限り 、 精製工程は 4 X で行っ た。 リ ゾプス - 二べウ ス の培養液の濃縮物であ る市 ¾の酵素剤ダ ル ク ザ ィ ム （天野製薬） 1 0 g を 4 0 π£の冷水に溶か して 1 時 間撹拌 した後、 1 0 0 0 0 rpm 、 1 0 分間の遠心によ つ て不純物を除いた。 一 2 0 て に冷却 したア セ ト ンを 6 0 % ( V / V ) にな る よ う に上清に加え、 3 0 分間、 0 て で撹拌した。 生成 した沈緵を、 1 0 0 0 0 rPni 1 0 分 間の遠心で集め、 4 0 m£の冷水に溶か し た。 溶液を再度 遠心 し、 上清を 5 0 111 丁 1" 1 5 — 11 〇 1 ( pH 7 . 5 ) で平衡化 した D E A E —セ フ ア デ ッ ク ス A — 5 0 カ ラ ム ( 2 . 6 cni X 3 5 cm ) に食荷 し た。 カ ラ ムを 1 O O m M から 3 0 O m Mの食塩濃度勾配で溶出 した。 プロ テア一 ゼ活性の あ る 画分を 1 % S D S と 0 . 5 % 2 _ メ ルカ プ ト エ タ ノ ールを含む溶液中で 1 0 分間沸騰させた後、 JS 外濾過膜を用 いた ミ ニ コ ン （ ア ミ コ ン社製） で濃縮 し ^ 濃縮物は 0 . 1 % 3 0 3 — 1 0 0 111 【 3 〇 1 で平衡化 した G 3 0 0 0 S W (東洋曹達社製） カ ラ ム で高速液体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ーを行っ た。 溶出画分は S D S — ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 （ S D S — P A G E ) で単 一のパ ン ドを示し たので、 こ の画分を锖製酸性プロ テ ァーゼと した。 なお、 S D S — P A G E にお ける移動度 か ら計算 した本酵素の分子量は約 3 7 , 0 0 0 と推定さ れた。
    [0109] (2) ア ミ ノ 酸分析
    [0110] 次に、 当該プ π テア ーゼのア ミ ノ 酸組成を調べた。 即 ち、 精製 素を 6 規定の塩酸で加水分解後、 加水分解物 をア ミ ノ 酸分圻機 M L C 7 0 3 (ア ト 一社製） で分圻し、 ア ミ ノ 酸組成を決定した。 その結果を第 1 表に示す。 同 表中、 力 ッ コ ！ ¾はク ロ ノ ら によ って報告された酸性プロ テア一ゼのア ミ ノ 酸組成であ り 、 本発明の酸性ブロ テ ァ一ゼは、 ァ ミ ノ 酸組成およびァ ミ ノ 酸数において ク ロ ノ ら の報告によ る も の と明 らかに異なる こ とが分る 。 第 1 表 ア ミ ノ 酸組成
    [0111] 922649 Q"- 4 Q003882804.
    [0112]
    [0113] T r p N D 計 3 3 2 ( 3 2 7 )
    [0114] (表中、 数字は酸性プロ テ アーゼ 1 分子中の ア ミ ノ 酸の 数を示す。 A s x ば A s p と A s n の合計、 G l x は G 1 u と G 1 n の合計を示す。 N D は測定してい ない こ と を示す。 ）
    [0115] (3) ア ミ ノ 酸配列分圻
    [0116] 続いて、 当該精製酸性プロ テ アー ゼ の N末端ア ミ ノ 酸 配列を、 自動化エ ド マ ン分解法によ っ て決定 し た。 その 結果、 以下,の如 く であ っ た。
    [0117] A l a - S e r - G l y - S e r - V a 1 一 P r o - M e t — V a 1 — A s p — T y r — G l u — A s n — ' A s p - V a 1 - G l u '- T y r - '
    [0118] さ らに、 当該精 .製酸性プ ロ テアーゼの分子中 のぺプチ ド断片の ア ミ ノ 酸配列を調べる ため 、 当該'酵素を リ ジル エ ン ド べプチダーゼで分解 して得 ら れる 分解物 （即 ち、 ペプチ ド断片） を C 1 8 逆相カ ラ ム ( Shiaapak 0DS、 島 津社製） を用 いた高速液体ク π マ ト グラ フ ィ 一で精製し た。 リ ジ ルエ ン ド べプチダ一ゼによ る分解は、 精製酸性 プロ テアーゼを 2 0 の 0 . 0 7 5 % S D S - 6 0 m
    [0119] M T r i s - H C 1 ( pH 9 . 0 ) に 1 gノ にな る よ う に溶か し、 5 の リ ジルェ ン ド ぺプチダ一ゼを加えて、 3 7 て で、 1 6 時間反応 し た。 単離 した 5 つ の ペプチ ド 断片について、 そ のア ミ ノ 酸配列を アプ ラ イ ド · ノ ィ ォ シ ス テ ム社製のモ デル 4 7 0 A機を用いて、 自動化エ ド マ ン分解法に よ っ て決定し た。 その結果、 以下の如 く で あ た
    [0120] ① L e u X - P h e - A s p - X - G l y
    [0121] S e r S e r - X - M e t 一 X — P h e
    [0122] X — X X - L e
    [0123] S e r S e r - T h r T y r A 1 a
    [0124] A 1 a A s p G 1 7 A r g T h r
    [0125] T r p S e r I 1 e S e r T y r
    [0126] G 1 y A s p G 1 y S e r S e r
    [0127] ③ G 1 n T h r I 1 e 一 G 1 u — L e u
    [0128] A 1 a
    [0129] ④ A r g G 1 u S e r — S e r — A l a
    [0130] P h e A 1 a T h r — A s p — V a l
    [0131] I I e A s G 1 y — L e u — L e u
    [0132] I 1 e G 1 y G l y - T h r - T h r
    [0133] V a 1 S e r X — S e r — P h e - X
    [0134] A 1 a - X - X - A s p
    [0135] (但 し、 X は未同定のア ミ ノ 酸残基を示す） 。
    [0136] (4) 至適
    [0137] 前記（1) の記載に従っ て'椿製さ れた酵素溶液を適当な濃 度に希釈 し、 各 ρΗの 0 . 1 Μ乳酸緩衝液 （ 0 . 6 %ハ ン マースタ イ ン カゼィ ンを基質と して舍む） で、 活性を 测定した （第 5 図参照） 。 そ の結果、 本発明酵素の至適 ΡΗは 3 . 0 〜 3 . 5 であっ た。 ク ロ ノ ら によ っ て報告さ れた酸性プ π テア一ゼの至適 は 3 . 5 〜 4 . 0 であり、 本発明酵素と は異な ってい る。 実施例 2 リ ゾブス由来酸性プロ テ アーゼ遺伝子の製造
    [0138] (1) リ ゾプス遺伝子ラ ィ ブ ラ リ ーの作製
    [0139] 酸性プ α テアーゼ生産菌 ni veus Yaraazaki IF04810 力、ら ノヽ イ ンズ らの方法 （Hynes, M. J. e t a 1. , Molec. C ell. Biol. , Vol. 3, 1930)によ り 全 D N Aを単離し た。 こ の D N Aを制限酵素 S a u 3 A I で部分分解 し、 蔗耱 密度勾配遠心法に よ り 8 〜 1 5 kbの画分を集めた。 こ の 8 〜 1 5 kbの D N A断片を B a m H I 処理 した ベク タ一 P B R 3 2 2 と T 4 リ ガーゼで結合 し、 大腸菌 J A 2 2 1 を形質転換 して、 ア ン ビ シ リ ン耐性形質転換体と して リ ゾブス の遺伝子ラ イ ブラ リ ーを取得 した。 大腸菌の形 質転換は常法を用いた。
    [0140] 12) 遺伝子ラ イ ブ ラ リ 一の ス ク リ ーニ ング
    [0141] 形質転換体を選択す る た めに、 酸性プ ロ テア ーゼ遺伝 子檢出用 のプ ロ ーブを作製 した。 プ ローブの作製は、 前 記実施例 1 に示す当該酸性プロ テア ーゼ の N末端ァ ミ ノ 酸配列の一部であ る M e t - V a 1 — A s P - T y r 一 G 1 u - A s n - A s p - V a 1 — G l u _ T y r の部 分について、 その ア ミ ノ 酸配列に対応す る コ ド ン力、 ら、 3 ' - T A G C A N C T P A T P C T Q T T - 5 ' の 1 7 個の塩基か ら なる 3 2 種の合成 D N Aオ リ ゴマー ( 1 7 — m e r プローブ） と、 3 ， 一 T T A C T P C A P C T N A T - 5 ' の. 1 4 個の塩棊か ら な る 1 6 種の合 成 D N Aオ リ ゴマー （ 1 4 一 m e r プロ ーブ） を合成 し た。 こ こ で N は任意の塩基であ り 、 P は Aま たは Gであ り 、 Qは Tま たは Cを示す。
    [0142] これら の D M Aオ リ ゴマーを 〔 r — 32 P 〕 A T P と T 4 ボ リ ヌ ク レオチ ドキ ナ一ゼを用いて標識し、 酸性プ ロ テア 一ゼ遺伝子検岀用プロ ーブと して用いた。 酸性プロ テア一ゼ遺伝子を持っ たク 口一 ンを選択する ための コ ロ 二一ノヽィ ブ リ ダイ ゼー シ ョ ンは、 グ レ ン スタ イ ンと ホグ 不 ス の方法 brunsteiii, M . and D . S . Hogn es s , Pr oc . Natl . Acad. Sci . USA. , vol . 72 , 3961) を若干改良し た方法によ り 、 42て、 48時間で行っ た。 約 2 万値の ク 口一 ンをス ク リ ーニ ング した結果、 前述の 1 4 m e r ブ 口一ブ と 1 了 m e r プローブの両者にハ イ ブ リ ダィ ズす る ク ロ ー ン と して、 プ ラ ス ミ ド p P R 0 7 を持つク ロー ン が選抜さ れた。 P P R 0 7 は 7 . 4 k bの リ ゾブス由来 の D N A靳片を持つ。 筒、 ？ ？ 1^ 0 7 を もっ大腸菌 八 2 2 1 の ク ロ ー ン ば S A M 7 6 0 と命名 され、 微ェ研に F E R M P - 9 5 1 9 の寄託番号を得て寄託されてい る β
    [0143] (3) 酸性プロ テア一ゼ遺伝子の塩基配列
    [0144] 上記のプラ ス ミ ド p P R 0 7 の 7 . 4 kb揷入 D N 断 片の う ち、 両プロ 一ブ とハ イ ブ リ ダィ ズする約 2 kbの D N A断片について、 サ ンガーら の方法 （Sanger , F. et a 1· , Proc . Natl- Acad. Sci . USA, vol . 74, 5463)に よ っ てその全塩基配列を決定した。 第 1 図 （ a ) な い し ( d ) に決定された塩基配列を示す。 こ の块定さ れた塩 基配列中に は ィ ン ト ロ ンが存在 して いたが、 実施例 1 に 示 し た当該酵素のぺプチ ド断片のァ ミ ノ 酸配列 と の比較 から、 酸性プ ロ テ ア一ゼの全構造 （ ア ミ ノ 酸配列） も、 下記のよ う に して決定された。 同図に は こ う して塩基配 列か ら導かれたア ミ ノ 酸配列も併せて示す。 塩基配列中、 アル フ ァ べ ッ ト大文 はェ ク ソ ン部分、 ア ル フ ァ べ ッ ト 小文字はイ ン ト ロ ン部分を示す。 ア ミ ノ 酸配列中、 下線 部は、 リ ゾブス培養物か ら精製された酸性プロ テアーゼ のべプチ ド断片を ァ ミ ノ 酸配列分折にかけて決定さ れた ア ミ ノ 酸配列を示 し、 破線部はア ミ ノ 酸配列分折で は同 定で き なかっ たァ ミ ノ 酸配列を示す。
    [0145] 決定した塩基配列ば 1 9 5 9 塩基か ら な り 、 当該酸性 プロ テア 一ゼ遺伝子の全領域を含んでい る。 第 1 図にお いて 5 1 2 番目 の A T Gか ら始ま る読み枠に は、 8 4 8 番目 と 8 9 8 番 目 に各 々 T G A、 T A G の終止コ ド ンが 出現する が、 こ れはこ の部分がイ ン ト ロ ンで あ る こ とを 示唆 している 。 こ の こ とを確認する ため に、 当該酸性プ 口 テアーゼをプロ テア 一ゼ処理 して得 ら れる 前記の 5 個 のぺプチ ド断片のァ ミ ノ 酸配列及び酸性プロ テ アーゼの N末端ア ミ ノ 酸配列と 、 塩基配列か ら推定さ れる ァ ミ ノ 酸と の比較を行っ た と こ ろ、 両者は完全に一致 した （第 1 図参照） 。 ま た酸性プロ テア 一ゼのア ミ ノ 酸組成 と、 塩基配列か ら推定さ れる ア ミ ノ 酸組成も一致 し た （第 2 表参照） 。 以上の点か ら 当該酸性プロ テ アーゼ遺伝子は 8 3 7 番目か ら 9 0 0 番目迄の 6 4 塩基か ら な る イ ン ト n ンを舍む こ とが明 ら かになっ た。
    [0146] (4) 酸性プロ テアーゼの構造解折
    [0147] 第 1 図に示 した塩基配列の解折の結果から 、 当該酸性 プロ テア一ゼの前躯体は、 5 1 2 番目の A T Gか ら始ま り 、 1 7 4 3 番目 の T A Αで終わる読み梓に コ ー ド され る 3 8 9 ア ミ ノ 酸か ら なる と考え られる。 リ ゾブス - ニ べゥ スの培養物か ら精製さ れた酸性プロ テアーゼの N末 端ア ミ ノ 酸配列と一致する ア ミ ノ 酸配列が、 + 1 番目か ら + 1 6 番目 のア ミ ノ 酸までに認め られる こ とから、 成 熟型の酸性プロ テアーゼは、 + 1 番目のァ ラ ニ ンか ら始 ま り + 3 2 3 番目 のァ スパラギ ンで終わる 3 2 3 ァ ミ ノ 酸か らな る。 なお、 一 6 6 番目 のア ミ ノ 酸メ チォニ ンか ら ー 4 4 番目 のア ミ ノ 酸プロ リ ンま での 2 3 倔のア ミ ノ 酸配列ば典型的な シグナル配列であ る。 当該酸性ブロテ ァ一ゼの前駆体 と成熟型酵素の比較か ら、 リ ゾブス酸性 プロ テア 一ゼは 6 6 ァ ミ ノ 酸からなる プ レブ口領域をも つ と推察される。
    [0148] なお、 第 2 表は、 本発明の遺伝子の塩基配列か ら導か れる新規な酸性プ ロ テアーゼの成熟蛋白質領域のァ ミ ノ 酸組成を、 ダルク ザィ ふから精製した酸性プロ テア一ゼ のァ ミ ノ 酸組成と比較 して示した も のである 。 第 2 表 ア ミ ノ 酸組成
    [0149] ア ミ ノ 酸 D N A
    [0150]
    [0151] 計 3 2 3 3 3 2
    [0152] N D は実験 しな力、 つ た こ とを示す * 第 1 表参照 実施例 3 酸性プロ テアーゼの遺伝子発現
    [0153] (1) 酸性プロ テア一セ "構造遺伝子からの ィ ン ト ロ ン配列 の除去
    [0154] 上記のよ う に、 本発明の染色俸由来の酸性プ ロ テア一 ゼ遺伝子には、 6 4 塩基か らな る ィ ン ト ロ ンが舍まれて いた。 こ の イ ン ト ロ ンを染色体由来の遺伝子か ら除 く た めに、 主に前に示 したゾラ 一 （ Zo 11 er) らの方法に従い、 化学合成 したオ リ ゴヌ ク レオチ ド断片を用いて部位特異 異 、 site directed autagenesis) 法を芙 し 7こ 0 以下で用—いた操作は特に示さ ない限り 、 マニア チス （T .
    [0155] Maniatis e t a 1： Molecular Cloning, し old Spring Ha v er Laboratory, New York, 1982)に徒っ た。
    [0156] 当該酸性プロ テアーゼの染色体遺伝子を舍むプラ ス ミ ド P P R 0 7 を制限酵素 S p h I および S a 1 I で処理 し、 ィ ン ト ロ ンを舍む 1 . 4 1)の 3 1 11 1 — 3 3 1 1 0 N A断片を得た。 得ら れた D N A断片は、 M l 3 m p 1 9 (宝酒造社よ り 購入） の S p h l — S a 1 I 部位に揷 入し、 組換え体一本鎮 D N Aを得た。 次に、 得 られた一 本鎮 D N A と、 5 ' — G C A T A A A G T G G A T G C A A A C C A C A T A T C A G - 3 ' の構造を持つ合成 ォ ゴヌ ク レオ チ ド A 2 0 0 と の混合液を 6 0 て で 2 0 分藺処理した後、 順次 3 0 'C で 3 0 分、 4 て で 3 0 分お .. よび 0 'C で 2 0 分間各々 保持する こ とによ り 、 一本鎮 D N A と合成オ リ ゴヌ ク レオ チ ド A 2 0 0 を結合させた。 その後、 上記反応液に ク レノ ウ - フ ラ グメ ン ト （Kletiow fragment) と T 4 D N A リ ガーゼ、 A T P およ びデォ キ シ リ ボヌ ク レ オ チ ド混合液を加え 1 2 て で 1 6 時間反応 させた後、 大腸菌 J M 1 0 9 に形質転換 した。 彫質転換 株は、 通常の プラ ーク ハ イ ブ リ ダィ ゼ一 シ ョ ン の手法に よ り 選択 した。 即 ち、 （ r 32 P ) A T P で標識 した上記 合成オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド A 2 0 0 をプ ロ 一ブ と して 、 変 異の起こ っ た遺伝子を舍むプラ ーク を選択 し た。 こ のプ ラーク か ら一本鎮および複製型の フ ァ 一ジ B - 7 を調製 した。
    [0157] (2) E c 0 R I 切断部位を持つ遺伝子の構築
    [0158] こ の よ う に して得 ら れた ィ ン ト ロ ン の な い酸性プ ロ テ ァ一ゼ遺伝子の翻訳開始コ ド ン A T G の 5 ' 側上流に、 制限酵素 E c 0 R I の切断認識部位を、 同 じ く 部位特異 的変異法を用 いて挿入 した。
    [0159] 化学合成 し たオ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド A 2 1 1 は、 5 ' ―
    [0160] G A A C T T C A T G A A T T C A G T A G A A - 3 ' の構造を持つ。 こ の合成オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド A 2 1 1 と 上記（1)で得 られた一本鎮フ ァ ー ジ B — 7 を用 いて再び Z oiler ら の方法に従い、 部位特異的変異法を行 っ た。 そ の結果、 当該酸性プロ テア ーゼ遺伝子の翻訳開始コ ド ン A T Gの直前に E c 0 R I の切断認識配列を持 っ た遺伝 子を舍む 目的のフ ァ ー ジ B C — 1 を得た。
    [0161] (3) 発現べク タ 一の製造
    [0162] 以上の よ う に して得 られたフ ァ ー ジ B C - 1 は、 IR 開始コ ド ン A T G の直前に E c 0 R I 切断部位が揷入さ れ、 イ ン ト ロ ンを欠いた酸性プロ テア一ゼ遺伝子の前半 部分を舎んでいる 。 こ の D N Aを用いて酵母由来のダリ セ ロ アルデ ヒ ド 3 — リ ン酸脱水素酵素 （ G A P ) の発現 調節部位 （プロ モータ 一） に酸性プ口 テアーゼ遺伝子を 直接結合した発現べク タ一を製造した。
    [0163] 本ベク ターの製造にあた っては、 p γ g a p 8 7 ( F
    [0164] E R M B P — 3 8 2 と して 1 9 8 3 年 1 0 月 にェ 業技術院微生物工業技術研究所にブダぺス ト条約の規定 に基づいて国際寄託されている ） と P Y G I F L IE 2 1 2 ( F E R M P — 7 7 2 7 と して 1 9 8 4 年 7 月 1 7 曰 に工業技術院徵生物工業技術研究所に寄託さ れてい る ） を出発プラ ス ミ ド i して用いた。
    [0165] 即ち、 p Y G I F L m 2 1 2 に唯一存在する B a m H I 切断部位を制限酵素で開裂後、 D N Aボ リ メ ラーゼ I を用いて付着末篛 （ ス テ ィ ッ キ ングエ ン ド） を フ ィ ル イ ン ( Fill- in)した。 鐃いて、 その部位に H ϊ n d ffi ( 5 ， 一 C A A G C T T G — 3 ' ) リ ンカ 一を挿入する こ と によ り H i n d m切断部位を持つプラ ス ミ ド p Y G I F L m 2 1 2 H を製造した。 また、 p Y g a p 8 7 に、 前に示 したの と同様の部位特異的変異法を用いて G A P 構造遺伝子の II訳開给コ ド ン A T G の直前に E c 0 R I 制限酵素の切断認識部位を作製 し、 プラ ス ミ ド p Y g a
    [0166] P 8 7 E を製造した。 プラ ス ミ ド p Y G I F L m 2 1 2 H を E c 0 R I で完全に切断し、 さ らに反応時藺を調整 する こ と によ り H i n d ΕΓで部分的に切断した後、 8 . O kbの断片を分離 した。 ま た、 p Y g a p 8 7 E を E c 0 R I と H i n d IK で切断後、 G A P 遺伝子の プロ モ一 ター領域を含む 1 . I kbの断片を分離 し た。 こ の断片 と 上記の 8 . O kbの断片 とを ラ イ ゲー シ ヨ ン した後、 大腸 菌を彤質転換 してそ こ から ブラ ス ミ ド p Y G I F L m 2 2 2 を得た。
    [0167] こ のよ う に して製造された、 P Y G I F L m 2 2 ·2 と 複製型フ ァ ー ジ B C — 1 を E c 0 R I と S a 1 I で消化 した後、 それぞれ、 約 8 kbと約 0 . 7 kbの断片を面収し た。 これ ら の D N A断片を ラ イ ゲ一 シ ヨ ン して得 ら れた プラ ス ミ ドを P Y P R 2 7 3 と命名 した。 さ ら に こ の P Y P R 2 7 3 を S a 1 I で切断 し， それ と は別に P P R 0 7 の酸性プ ロ テアーゼ遺伝子の後半部分を舍む約 2 . 3 kbの S a 1 I 断片を酉収 して ラ イ ゲ一 シ ヨ ンを行 っ た。 その結果、 S a 1 I 断片の挿入方向によ り 二種類のべク ターが得 ら れ E。 その う ち、 酸性プ ロ テアーゼ遺伝子が 正し く 結合 し た も のを制限酵素によ る解圻で選択 し、 P Y P R 2 7 3 1 と命名 した （第 3 図参照 ） 。
    [0168] こ れと ば別に、 酸性プロ テア ーゼ遺伝子由来のプロ モータ ーでの発現を検討す る た め に P Y P R 7 3 1 をさ ら に コ ン ト ロ 一ノレのベ ク タ 一と して、 p Y E 2 0 9 を製 造した。 プラ ス ミ ド p Y P R 7 3 1 の作製ば以下の方法 によ っ た。 上記の P Y G I F L m 2 2 2 を制限酵素 S a 1 I と H i II d ill で部分消化 して得 られる 7 . 2 kbの D N A断片 と上記の複製型フ ァ 一 ジ B C — 1 を H i n d 1 と S a l I で消化 して得られる 1 . I kbの D N A断片を ラ イ ゲー シ ヨ ンさせ、 P Y P R 7 3 を作製し た。 こ のプ ラ ス ミ ド P Y P R 7 3 を S a 1 I で消化し、 p P R 0 7 の S a i l 消化で得 られた 2 . 3 kbD N A と の ラ イ ゲ一 ショ ンを行っ て目的のベク タ 一 p Y P R 7 3 1 を製造し た。 得ら れた P Y P R 7 3 1 では、 本発明の酸性プロ テ ァ一ゼ遺伝子由来のプ ロ モータ ーが E c 0 R I 切断認識 配列を介 してイ ン ト ロ ンのない 当該構造遺伝子に結合さ れてい る 。 p Y E 2 0 9 は、 酵母の発現プラ ス ミ ドのべ ク タ 一のみか らな り 、 p Y G I F L m 2 2 2 を H i n d ffiで部分的に分解後、 G A P プロ モータ 一等を舍ま ない 約 7 l bの靳片を靣収し、 セ ルフ ラ イ ゲ一シ ヨ ン させ る こ とによ り 得ら れる （第 4 図参照） 。 筒、 ベク タ一 P Y P R 7 3 i と p Y G I F L m 2 2 2 を使っ ても、 上記のプ ラ ス ミ ド p Y P R 2 7 3 1 と実質的に同 じも の は容易に 製造する こ とがで き る。
    [0169] (4) 酸性プロ テア一ゼ遺伝子の発現
    [0170] a ) 平板寒天培地上で の発現
    [0171] 得られた 3 種のベク タ一 （ P Y P R 2 7 3 1 、 P Y P R 7 3 1 および P Y E 2 0 9 ) を用いて酵母 R 2 7 — マ C - 1 C ( MATa, leu2, his3, trpl, ura3) を形質転換 し、 得ら れた形質転換酵母をそれぞれ R — 2 7 3 1 , R — 7 3 1 および R — 2 0 9 と命名 した。 尚、 ィ ン ト ロ ン の除去さ れた リ ゾプス由来の酸性プ π テア一ゼ遺伝子を 持つベク タ ー ； p Y P R 7 3 1 で形質転換された酵母 R — 7 3 1 は、 S A M — 0 9 9 7 の名称で 1 9 8 8 年 3 月 3 日付けで工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ れ、 F E R M P — 9 9 0 9 の寄託番号を得てい る 。 こ れ ら の形質転換体を用 い、 ノ、 ンマース テ ンカ ゼィ ンを舍むプ レ一 ト上で の ハ ロ ー ¾成に よ る 酸性プ ロ テア 一ゼ生産能 を検討 した。 培地 と してィ 一ス ト ナ イ ト ロ ジ ェ ン ベー ス (Yeas t ni trogen base without amino acid, D ι f c o 社） 1 %ノヽ ン マー ス テ ンカ ゼィ ン （Casein n ach H MM ARS T E I , MEBCK 社） 、 2 %寒天および各 0 . 0 0 1 %の 口 イ シ ン、 ヒ ス チ ジ ンお よ .び ゥ ラ シルを舍む Y N B — L H U寒天培地を用いた。 こ の培地上に生育 した形質転換体 が、 プロ テアーゼを分' ¾S生産すれば菌体のま わ り のカ ゼ イ ンが分解さ れ、 透明なハ ロ ーを彤成する 。 各 々 の形質 転換体を こ の培地上に ス ト リ ーク し、 3 0 'C で培養 し 1 日 目 、 2 日 目 の ハ ロ ーを観察 した。 コ ン ト ロ ー ルの R — 2 0 9 株ば、 2 日 目 で も全 く ノ、 口 一が形成さ れ'な いが、
    [0172] R - 7 3 1 株には 2 日 百にハ ロ ーが形成さ れた。 さ ら に プロ モータ 一を酵母由来の も の に変換 した R — 2 7 3 1 株は、 1 日 目 で早 く も ハ ロ ーの岀現がみ られ、 2 日 目で は透明で大き なハ ロ ーが形成さ れた。
    [0173] こ の こ とか ら、 本発明の酸性プロ テア ーゼが当該遺伝 子を組み込んだ形質転換体によ り 生産さ れる こ とが示さ れた。 こ の時、 遺伝子発現に必要な プロ モータ ーは,.当該 酸性プロ テアーゼ遺伝子由来の も の であ って も よ い し、 ま た異種由来の も のであ っ て も良い こ と は上記の実験か ら明 らかであ る。 さ ら に、 本発明によ り 当該酸性プ口テ ァーゼ遺伝子の シグナルぺプチ ドを コ 一 ド している領域 を利用すれば、 下記 b ) で詳細に確認さ れる とおり 、 本 酵素を菌体外に分铋生産させう る こ と も ま た示された。 b ) 液体培養によ る発現
    [0174] 上記の彤質転換酵母、 R — 2 7 3 1 を用いて液体培養 後の培養上情中に分涎生産されたプ ロ テアーゼの性質に ついて、 S D S —ボ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動を用 いて調べた。 筒、 コ ン ドロ一ルと して、 当該酸性プロ テ ァ一ゼ a伝子で形質転換さ れていない上記.の酵母 R — 2 0 9 を用 いた。 - 酵母菌体は Y N B — C M培地 （ Y N B — L H U培地に 2 %カ ザ ミ ノ 酸を加えた培地） に 1 白金耳植菌 し、 3 0 て で 1 6 時間振と う 培養し、 こ れを前培養と した。 次に、 同 じ培地に前培養した菌を 1 %植菌し、 その 2 8 時間目 と 4. 8 時藺目の培養液を採取 し、 そこか ら遠心分 離した上清液を酵素サ ンプルと した。 S D S —ポ リ ァ ク リ ルア ミ ド ゲル電気泳動を行っ たと こ ろ、 R — 2 7 3 1 の培養 i清に のみ特異的に蛋白質の ベ ン ドが二本検出さ れた。 サ イ ズマーカ 一 と比較し た と こ ろ、 分子量の大き い方のバ ン ド は前躯体蛋白質の持つ分子量に対 し、 小 さ いバン ドば成熟蛋白質のそれに対応した。 更に、 その 二つの蛋白質のゲル上のバ ン ド の瀵さで判断 した量比は、 2 4 時間目 と 4 8 時簡目 にそれぞれ採取 したサ ンプルで 比較する と、 後者の方が成熟蛋白質の割合が増加してい た。
    [0175] 以上の結果、 本発明の酸性プロ テア一ゼ遺伝子を組み 込んだ 質転換酵母 R — 2 7 3 1 は培地中に 当該前駆体 酵素と成熟酵素の 2 種類の蛋白質を分秘生産 してい る こ とが確認された。
    [0176] 次に、 培養液中に分铋生産さ れた 当該酸性プ ロ テア一 ゼの量を上記の酵母 R — 2 7 3 1 と R — 2 0 9 を用いて 測定 した。 即ち、 0 . 6 %ハ ンマース テ ンカ ゼ イ ンを舍 む 0 . 1 M乳酸 （ N a 0 H で pHを 3 . 1 に調整する ） 5 0 0 に、 前記 b ) と同様に調製し た酵母培養液の上清 1 0 0 を加え、 3 7 て 1 0 分間反応さ せた後、 停止液 ( 0 . 1 1 M T C A , 0 . 2 2 M酢酸ナ ト リ ウ ム ， 0.
    [0177] 3 3 M酢酸） 5 0 0 を添加して反 を終了 した。 そ の 後、 遠心分離によ り 沈殺物を除いた の ち 2 7 5 nmの吸収 を測定 し た。 チ ロ シ ン ： L agノ ^ の A 2 7 5 は 0 . 0 0 7 1 である こ とか ら 、 1 分間に 2 7 5 nmの吸収変化が 0 . 0 0 7 1 であ る と き そ のプロ テ ア一ゼ活性を 1 ュニ ッ ト と した。 こ の方法で R — 2 0 9 およ び R — 2 7 3 1 株の
    [0178] 4 8 時間目 の培養上清活性を測定し た と こ ろ、 活性はそ れぞれ 1 あ た り 5 4 および 4 5 1 ユニ ッ ト であ っ た。 こ の結果、 本発明によ り 製造さ れた形質転換株で は、 液 体培養に よ っ て も酸性プロ テア 一ゼを劲率良 く 分泌生産 して い る こ とが確かめ られた。
    [0179] 産業上の利用可能性
    [0180] 本発明の酸性プロ テアーゼ遺伝子は、 適当 な発現べク タ一に組み込んで酵母その泡の微生物中で発現させ、 大 量に酸性プロ テアーゼを生産させる こ とが可能であ る。
    [0181] 本発明の酸性プ π テア一ゼの製造方法は、 徒来の リ ゾ プス属糸状菌の證培養でな く 、 液^培養を利用でき るた め、 工業的実施に非常に適 る 。
    [0182] こ う して得 られる酸性プロテアーゼは、 食品加工工業、 皮革工業、 醸造工業あ る い は洗剤工業などの広範 fflの産 業に利用で き る と期待される。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1 . リ ソ * フ。 ス · 二 べ ウ ス ( h i zopus ni veus) iこ属する糸 状菌由来の酸性プロ テアーゼ遺伝子。
    2 . 下記の式 I のア ミ ノ 酸配列を有する酸性プ ロ テア一 ゼを コ ー ドす る D N A塩基配列を含む、 請求の範囲第 1 項記載の酸性プロ テアーゼ遺伝子 ：
    X- Ala Ser Gly Ser Val Pro Me t Val Asp T r 10
    Gl u Asn Asp Val G l u Tyr Tyr Gl y Gl u Va l 20
    Tfar Val Gly Thr Pro Gly l i e Lys Leu Lys 30 Leu Asp Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Me t
    50
    T r p Phe Ala Ser Thr Leu Cy s Ser Ser C y s
    Ser Asn Ser His Thr Lys Tyr As Pro Lys
    L s Ser Ser Thr Tyr Ala A l a Asp Gly A r g 70
    SO
    Thr Trp Ser l ie Ser Tyr G ly Asp Gly Ser
    Ser A 1 a Ser Gly l ie Leu A 1 a Thr Asp As n
    Val Asn Leu Gl Gl y し eu Leu l ie Lys Lys
    Gin Thr l ie Glu Leu A 1 a Lys Arg Glu Ser 10
    Ser Ala Phe Ala Thr Asp Val l i e Asp &1
    Leu Leu G ly Leu Gly Phe Asa Thr l ie Thr 30 Thr Val Arg Gly Va l し ys Thr Pro Val ksp
    Asn Leu l ie Ser G i n Gly Leu l i e Ser Arg so
    Pro l i e Phe Gly Va l Tyr Leu Gly L s Gi n
    Ser Asn G 1 G 1 G 1 G ly G l u Tyr l i e Phe
    G l y G ly T r Asp Ser Ser Lys Phe Lys G 1
    Ser Leu Thr Thr Va l Pro l i e Asp Asn Ser 90 Glu G ly Phe Trp Gly Val Thr Val Lys Ser
    Thr Lys lie Gly Gly Thr Thr Val Ser Ala 2 1
    Ser Phe Asp Ala lie Leu Asp Thr Gly Thr 2 20
    Thr し en Leu Leu Leu Pro Asp Asp Val Ala 2 30
    Ala Lys Va 1 Ala Arg Ser Tyr Gl la Ser is p Asa Sly Asp Gly Thr Tyr Ser lie Thr 2 50
    Cys As Thr Ser Lys Leu G 1 a Pro Leu Val Z 60
    Phe Thr Leu Gly Ser Ser Thr Phe Glu Val 2 70
    Pro Ser As Ser Lea lie Phe Glu L s As 2 80
    Ely Asn Lys Cys lie Ala Giy Phe Ala Ala 2 90
    Gly G 1 y As Leu Ala I le Leu Gly Asp V l
    Phe Leu Lys As II Asn Tyr Val Val Phe As n
    Gin Glu Val Pro Glu Val Gin lie Ala Pro 3 20
    Val Ala Asn COOH
    ( I )
    ( 式中、 X ば水素原子ま た は次式 IE :
    Lys P e Thr Leu lie Ser Ser C s Val
    A 1 a Leu Ala Ala Met Thr Leu Ala Val Glu Ala la Pro Asn &I L s Lys lie Asn lie
    Pro Leu ft 1 a L s sn Asn Ser Tyr L s Pro
    Ser Ala L s Asn Ala Leu Asn Lys Ala Leu
    A I a Lys Tyr ftsn Arg Ar Lys Val Gly Ser
    Gly Gly lie Thr Thr Glu
    ( HI ) のア ミ ノ 酸配列で表さ れる ペプチ ドを示す） 。
    3 . 下記の式 Π で表さ れる D N A塩基配列、 ま た は こ の D N A塩基配列がコ ー ドする ァ ミ ノ 酸配列と実質的に同 等の ァ ミ ノ 酸配列をコ ー ドする D N A塩基配列を舍有す る、 請求の範囲第 2 項記載の酸性プ ロ テ ア一ゼ遺伝子 ：
    Y- GCC ftGT GGC TCT GTT CCT ATG GTT G&T TAT 30 GAA AAC GAT GTT GAA TAC TAC GGT GAA GTC ACT GTT GGT ACT CCT GGT ATT AAG CTC AA 90
    CTT GAT TTT. GAT ACT GGT TCT TCT GAT ATG
    TGG TTT GCA TCC ACT TTA TGC TCT TCT TGC 1 50
    AGC A AT TCT CAT ACT AAG TAT G T CCT AAA
    AAA TCA 5GC ACT TAC GCT GCC GAC GGT CGC
    ACT TGG TCC ATC TCT T¾C GGT G T GGC TCT 2 40
    AGC GCA AGC GGT ATC TTA GCT ACA GAC AAT 2 70
    GTC A AC CTT GGA GGT CTC TTG ATT AAA AAG 3 00
    C ACT ATT GAA TTA GCC AAG CGT GAA TCT 3 3ひ
    AGT GCA TTC GCT ACA GAT GTG ATT GAT GGT 3 60
    CTC TTG GGT CTT GGT TTC AAC ACG ATT ACA
    ACC GTT CGT GGC GTC G ACT CCA GTC GAC
    AAT TTG ATC AGT CAA GGT TTG ATC AGC AG A 50
    CCC ATC TTC GGT GTT TAT CTC GGT AAG CA A 80
    AGC AAC GGA GGT GGA &GT GA TAT ATC TTT
    GGT GGC TAT G C TCC TCC AAG TTC AAG GGT
    TCC TTA ACT ACT GTC CCT ATC GAT AAC TCA GAA GGC TTC TGG GGT GTT ACT GTC AAG AGC 6 00
    ACC AAG ATA GGT GGC ACA ACA GTT TCT GCT 6 30
    TCC TTT GAT GCT ATC CTC GAC ACT GGT ACC b 60
    ACT CTT TTA CTT CTT CCT GST GAC GTT GCT 6 90
    GCA AAG GTG GCT Q TCT TftT GGT GCT TCC 7 20
    GAC AAC GGC GAT GGT ACT TAC AGT fiTC ACC 7 50
    TGT GAT ACT TCC AAG CTT CAA CCT CTT GTC 7 80
    TTC ACC CTT &GT TCT TCC ACC TTC GAft GTT 8 10
    CCC TCT GAC TCC CTC ATC TTT GAS AAG GAT 8 40
    GGT AAC AAA TGT fiTT GCT GGT TTT GCT GCT 8 70
    GGT GGT GAT CTT GCC ATC TTG GGT GAT GTC 9 00
    TTT TTG AAG AAC AAC TAT GTT GTC TTT AAC 9 30
    CAA GAA GTC CCT GAA GTT CAA. ATT GCA. CCT 9 60 GTT GCC AAT TAA 9 72
    ( I )
    (式中、 Y は存在しないか或い は次式 W ：
    AAG TTC ACT TTA ATC TCC TCC TGT GT A.
    GCS CTT GCT GCC ATG ACA CTT GCT GTC GAA
    GCT GCA CCC AAC GGC A G AAA ATT AAC ATT
    CCT TTG GCC AAG AAC AAC SGC TAC AAA CCT
    AGC GCC AAA AAT GCA. CTT AAT AAG GCT CTC
    GCC AAG TAC AAT AGA AGA AAG GTT GGA AGC GGA. GGA ATT ACA ACC GAG
    ( W )
    で表さ れる D N A塩基配列を示す） 。
    4 . 前記式 II の Y の直前に翻訳開始コ ド ン A T Gを有 し、 該詡訳開始コ ド ン の直前に制限酵素 E c 0 R I 切断認識 部位を持つ請求の範囲第 3 項記載の遺伝子。
    5 . 請求の範囲第 3 項記載の遺伝子を舍有する 組換えべ ク タ一。
    6 . 請求の範囲第 4 項記載の遺伝子を舍有す る 組換えべ ク タ 一。
    7 . 酸性プロ テア一ゼ遺伝子を発現 ¾来る よ う に、 そ の
    5 ' 上流側に、 当該遺伝子由来と異なる プロ モ ータ 一が 結合さ れた請求の範囲第 5 項ま たは第 6 項記載の組換え ベク タ ー。
    8 . プロ モータ一が微生物由来であ る請求の範囲第 7 項 記載の組換えベク ター。
    9 . プロ モーターが酵母由来である 請求の範囲第 8 項記 載の組換えベク タ ー。
    1 0 . プロ モータ 一が酵母由来のグ リ セ ルア ル デ ヒ ド 3 一 リ ン酸脱水素酵素遺伝子のプロ モータ ー （ G A P ) で あ る請求の範画第 9 項記載の組換え ベク ター。
    1 1 . 請求の範囲第 5 項な い し第 1 0 項のいずれか 1 項 に記載の組換えべク タ 一を舍む形質転換細胞。
    1 2 . 宿主細胞が微生物で あ る 、 請求の範囲第 1 1 項記 寧の形質転換細胞。
    1 3 . 宿主細胞が酵母であ る、 請求の範囲第 1 2 項記載 の形質転換細胞。
    1 4 . 請求の範囲第 1 1 項ない し第 1 3 項の いずれか 1 項に記載の形質転換細胞を用いて酸性プ ロ テア一ゼを生 産する方法。
    1 5 . 請求の範囲第 1 4 項記載の方法で生産さ れた、 式 I のァ ミ ノ 酸配列を有する酸性プロ テアーゼ。
    1 6 . リ ゾ ブ ス - 二 べ ウ ス （ Rhizopus ni veus)に属する 糸扰菌の培養物か ら精製して得られる 、 S D S ボ リ ァク リ ルア ミ ドゲル電気泳動による推定分子量が約 3 Ί , 0 0 0 の酸性プ ロテアーゼであ っ て、 ア ミ ノ 末 ¾のア ミソ 酸配列が、
    A 1 a - S e r - G 1 y - S e r - V a 1 一
    P r o — M e t — V a 1 - A s p - T y r - G 1 u — A s n — A s p — V a 1 — G 1 u —
    T y r - であ り 、 かつ 下記式①か ら⑤までのァ ミ ノ 酸配列で示 される 5 個の プチ ド断片をその搆造中に舍有する酸性 プロ テアーゼ
    ① L e 一 X P h e A s p X 一 G 1 7 ―
    S e r 一 S e r X M e t X 一 P h e ―
    X X 一 X L e u
    ② S e r 一 s e r T h r 一 T y r 一 A 1 a 一
    A 1 a 一 A s P G 1 y 一 A Γ s 一 T h r ―
    - T r P 一 S . Q Γ I I e 一 S e Γ 一 T y r ―
    G 1 y 一 A S P G 1 7 一 s e Γ - S e r
    ③ G 1 11 一 T h r I 1 e 一 G 1 u 一 L e u ―
    A 1 a ④ A r g — G l u — S e r — S e r — A l a — P h e - A l a - T h r - A s p - V a 1 - I 1 e — A s p — G l y — L e u — L e u
    ⑤ I 1 e - G l y - G l y - T r - T h r - V a l - S e r - X - S e r - P h e - X - A l a - X - X - A s p
    (但 し、 上記ア ミ ノ 酸配列 Φの X は、 未同定の ア ミ ノ 酸 基を示す） 。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    JP2539775B2|1996-10-02|Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物
    JP4561010B2|2010-10-13|Ｄ−ヒダントインハイドロラーゼをコードするｄｎａ、ｎ−カルバミル−ｄ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードするｄｎａ、該遺伝子を含む組み換えｄｎａ、該組み換えｄｎａにより形質転換された細胞、該形質転換細胞を用いるタンパク質の製造方法、および、ｄ−アミノ酸の製造方法
    KR100372514B1|2004-04-30|효모균주및변형된알부민
    Bonhivers et al.1998|Aquaporins in Saccharomyces genetic and functional distinctions between laboratory and wild-type strains
    US5139936A|1992-08-18|Use of the GAL1 yeast promoter
    EP0096910B1|1989-04-19|Yeast of the genus kluyveromyces modified for the expression of preprothaumatin or its various allelic and modified forms or their maturation forms
    CA1337976C|1996-01-23|Insulin precursors
    Machida et al.1988|Nucleotide sequences of Saccharomycopsis fibuligera genes for extracellular beta-glucosidases as expressed in Saccharomyces cerevisiae.
    US5102789A|1992-04-07|Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
    JP3418388B2|2003-06-23|細菌におけるポリペプチドの翻訳後修飾およびそのための遺伝子を誘導するリーダー配列
    Viebrock et al.1982|The imported preprotein of the proteolipid subunit of the mitochondrial ATP synthase from Neurospora crassa. Molecular cloning and sequencing of the mRNA.
    DK175898B1|2005-05-30|Fremgangsmåde til at udtrykke ikke-gærprotein i en gærvært og transformeret gærvært samt anvendelsen af en transformeret gær til fremstilling af gærværten
    US5652116A|1997-07-29|Method for genetically manipulating peptide synthetases
    US4666847A|1987-05-19|Recombinant DNA means and method
    JP2882775B2|1999-04-12|ヒトーグリア由来神経突起因子
    KR920007666B1|1992-09-14|변형된 섬유소 용해제의 제조방법
    US4661454A|1987-04-28|GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
    US8114632B2|2012-02-14|Method of producing biologically active polypeptide having insulinotropic activity
    FI80720B|1990-03-30|Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
    KR20150058478A|2015-05-28|글루칸 중합체의 생성을 위한 글루코실트랜스퍼라제 효소
    KR930001117B1|1993-02-18|Dna 재조합 기술에 의한 폴리펩티드 제조방법
    US7238515B2|2007-07-03|Anti-Listeria bacteriocin
    AU698319B2|1998-10-29|Yeast strains
    US6861237B2|2005-03-01|Production of heterologous polypeptides in yeast
    JP2533470B2|1996-09-11|豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-03-09| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    [返回顶部]